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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9226 (2023) Citer cet article

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La rupture de l'intégrité de la barrière hémato-rétinienne sous-tend les changements pathologiques dans de nombreuses maladies oculaires, y compris la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nAMD) et l'œdème maculaire diabétique (DME). Alors que les thérapies anti-facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) ont révolutionné le traitement des maladies, de nouvelles thérapies sont encore nécessaires pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Pour aider à développer de nouveaux traitements, des méthodes robustes sont nécessaires pour mesurer les changements de perméabilité vasculaire dans les tissus oculaires dans des modèles animaux. Nous présentons ici une méthode de détection de la perméabilité vasculaire à l'aide de la fluorophotométrie, qui permet des mesures en temps réel de l'accumulation de colorant fluorescent dans différents compartiments de l'œil de la souris. Nous avons appliqué cette méthode dans plusieurs modèles de souris avec différentes fuites vasculaires accrues, y compris des modèles d'uvéite, de rétinopathie diabétique et de néovascularisation choroïdienne (CNV). De plus, dans le modèle murin JR5558 de CNV, nous avons observé avec un post-traitement anti-VEGF une réduction longitudinale de la perméabilité, dans les mêmes yeux d'animaux. Nous concluons que la fluorophotométrie est une méthode utile pour mesurer la perméabilité vasculaire dans l'œil de la souris et peut être utilisée sur plusieurs points de temps, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier l'animal. Cette méthode a le potentiel d'être utilisée à la fois dans la recherche fondamentale pour étudier la progression et les facteurs sous-jacents de la maladie, mais aussi pour la découverte de médicaments et le développement de nouvelles thérapies.

La perte de l'intégrité de la barrière sanguine entraînant un œdème et des lésions tissulaires ultérieures a été décrite comme un facteur contributif à une grande variété de maladies, notamment la septicémie1, le cancer2 et les accidents vasculaires cérébraux3. Dans l'œil, l'instabilité vasculaire et l'accumulation de liquide dans la rétine et les tissus environnants sont une caractéristique centrale de certaines des maladies menaçant la vue les plus courantes, telles que la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nDMA) et l'œdème maculaire diabétique (OMD), qui, si elle n'est pas traitée, peut entraîner une perte de vision rapide4,5,6,7. En outre, des maladies oculaires telles que le glaucome8 et l'uvéite9 ont également été associées à une perméabilité vasculaire accrue, bien que des recherches supplémentaires puissent être nécessaires pour définir ce lien avec l'étiologie de la maladie.

Les inhibiteurs anti-VEGF injectés par voie intravitréenne, tels que le ranibizumab et l'aflibercept, sont devenus une norme de soins pour le traitement de la DMLA et de l'OMD10,11 et ont révolutionné les résultats visuels des patients, bien que ces maladies continuent d'être les principales causes de déficience visuelle12, car tous les patients ne répondent pas au traitement anti-VEGF, et certains patients peuvent continuer à présenter des fuites de liquide rétinien ou sous-rétinien, ou développer une fibrose et une atrophie malgré le traitement. Pour aider à répondre à l'un de ces besoins non satisfaits, la nouvelle génération de thérapies est récemment entrée sur le marché, visant à restaurer la stabilité vasculaire de l'œil, comme le faricimab (VABYSMO ; Genentech/F. Hoffmann-La Roche Ltd.), un agent de croissance endothéliale vasculaire facteur (VEGF)–angiopoïétine (Ang)-2 anticorps bispécifique13,14,15.

Le développement de nouveaux traitements capables de prévenir les fuites vasculaires oculaires pathologiques se poursuit, à mesure que notre compréhension de ces maladies évolue. Pour aider à développer ces nouvelles thérapies, des modèles précliniques et des méthodes respectives sont nécessaires qui permettent de surveiller les changements de la perméabilité vasculaire au fil du temps. Les méthodes de perméabilité actuelles comprennent les techniques de perfusion au bleu d'Evan16,17, à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran18 et à la microsphère19, ainsi que des techniques basées sur l'imagerie telles que l'angiographie à la fluorescéine20,21 et la tomographie par cohérence optique de fuite à contraste exogène (OCT)22. Bien que bon nombre de ces techniques soient bien établies, elles peuvent également présenter certains défis et inconvénients, qui sont discutés plus en détail ailleurs20. Le procédé décrit ici peut également être utilisé en conjonction avec des techniques existantes.

La fluorophotométrie est un outil polyvalent utilisé depuis longtemps dans les contextes de recherche oculaire clinique et non clinique23,24. Les instruments fluorophotomètres ont été conçus pour mesurer la concentration de fluorophores dans les tissus oculaires25, et peuvent donc être utilisés pour déterminer la diffusion et l'élimination du colorant de référence, afin de fournir une indication de l'état physiologique du système vasculaire oculaire. Des instruments de fluorophotométrie sont disponibles pour des applications oculaires telles que l'écoulement aqueux, la pharmacocinétique des médicaments, la production de film lacrymal et les fuites vasculaires chez l'homme26, les rats27,28 et d'autres espèces29,30, mais jusqu'à relativement récemment31, cela n'était pas possible chez la souris, en raison des limitations de la taille de l'oeil. Dans cet article, nous examinons l'utilisation d'une nouvelle technologie accessible pour mesurer la perméabilité dans la rétine, le vitré et la chambre antérieure. Nous tentons de valider la technologie dans des modèles animaux de maladies oculaires, ainsi que de fournir un exemple de la façon dont elle pourrait être utilisée pour mesurer la perméabilité vitreuse après un traitement anti-VEGF, afin de démontrer son potentiel dans le développement de thérapeutiques. Ces résultats indiquent que la fluorophotométrie peut être utilisée pour surveiller et quantifier les changements dans les fuites vasculaires dans l'œil de la souris, qui pourraient également être utilisées parallèlement à d'autres méthodes existantes.

La première étape pour valider l'utilisation du fluorophotomètre de souris consistait à attribuer les distances axiales de l'analyse correspondant à la rétine, au vitré et à la cornée/chambre antérieure de l'œil de la souris. Pour détecter le vitré, nous avons commencé par injecter 20 ng de fluorescéine directement dans l'espace vitré central, suivi de mesures immédiates avec le fluorophotomètre à travers le vitré central. Un pic net a été observé entre 69 et 77 marches axiales (Fig. 1a). Suite à cela, nous avons ensuite administré 20 ng de fluorescéine par voie topique au même œil de souris, pour montrer la position de la cornée/chambre antérieure. Un pic entre 111 et 116 marches axiales a été identifié pour la cornée/chambre antérieure en plus du pic vitré (Fig. 1b). Chez une deuxième souris, l'injection intravitréenne (IVT) de 10 ng de fluorescéine (Fig. 1c) a entraîné un pic vitré d'environ la moitié de la taille de la dose de 20 ng (Fig. 1b), mais sur la même distance axiale. Cela a démontré la reproductibilité de la distance axiale indépendante de la dose de fluorescéine et une taille de pic dose-dépendante de l'injection IVT. Cependant, nous n'avons pas pu séparer les mesures de la cornée et de la chambre antérieure, en raison de contraintes de résolution spatiale.

Différencier les différents compartiments de l'œil sur les scans du fluorophotomètre de souris. Scans de fluorophotomètre effectués sur les yeux de souris C57Bl/6J, suivants ; (a) injection intravitréenne de 20 ng de fluorescéine, (b) injection intravitréenne de 20 ng de fluorescéine, suivie de 20 ng de fluorescéine appliquée par voie topique, (c) injection intravitréenne de 10 ng de fluorescéine, et (d) injection intravitréenne de 125 ng de 70 kDa FITC-dextran et injection intraveineuse de 2,5 mg de 70 kDa FITC-dextran (scans réalisés chez des souris séparées et regroupées sur une même parcelle). Des injections intravitréennes ont été réalisées dans le vitré central. Les étiquettes sur chaque figure montrent l'emplacement du vitré (central), de la chambre antérieure et de la rétine pour chaque œil de souris. AC = chambre antérieure ; IVT = intravitréen.

Après identification du vitré et de la cornée/chambre antérieure, nous avons ensuite cherché à différencier les compartiments vitré et rétinien. En utilisant du FITC-dextran de 70 kDa, dont la grande taille par rapport à la fluorescéine (poids moléculaire = 376 Da) l'empêche de pénétrer la barrière hémato-rétinienne et de diffuser de la rétine dans le vitré, nous avons injecté à une souris par voie intraveineuse (IV) 2,5 mg de FITC- dextran, et les pics comparés avec une autre souris ayant reçu 125 ng de FITC-dextran IVT. Chez la souris infusée IV, un pic a été détecté à une distance axiale de 51 à 55, correspondant à l'accumulation de FITC-dextran dans la rétine, tandis que dans l'œil de souris administré par IVT, le pic vitré a été détecté à une distance axiale de 69 à 74. La superposition des deux tracés montre que la séparation des compartiments rétinien et vitré est possible (Fig. 1d). Les longueurs de trajet pour la rétine, le vitré et la cornée/chambre antérieure identifiées sur la figure 1 ont servi de référence pour les futures mesures oculaires.

Après identification des différents compartiments oculaires de la souris par fluorophotométrie, notre prochain objectif était de déterminer la sensibilité de l'instrument fluorophotomètre pour détecter les changements dans les niveaux de dose de fluorescéine dans l'œil. Nous avons décidé d'utiliser la fluorescéine administrée par voie systémique, car cela a été le fluorophore de choix pour plusieurs études antérieures31,32,33, avec lesquelles nous pourrions ensuite comparer. Nous avons choisi initialement de tester deux voies systémiques pour l'injection de fluorescéine, IV et sous-cutanée (SC). Le dosage IV a l'avantage de permettre l'administration directe du colorant dans la circulation, donc n'introduit pas de variables d'adsorption supplémentaires. Cependant, dans nos mains, l'injection précise de petits volumes conduit à une plus grande variabilité, et plus de souris peuvent être nécessaires pour générer des ensembles de données (Figure 1 supplémentaire). En revanche, le dosage SC (Fig. 2) a produit des changements robustes dans l'intensité de la fluorescence, avec une faible variabilité des mesures oculaires inter-animaux.

Évolution de la dose-réponse et du temps après l'administration sous-cutanée de fluorescéine à des souris femelles C57Bl/6J. ( a ) Analyses représentatives et ( b ) quantification de la fluorescéine dans la rétine, le vitré et la chambre antérieure en moyenne après 30 min, chez des souris injectées avec 0, 25, 0, 50 et 1, 0 mg de fluorescéine par voie sous-cutanée. Cours temporels montrant les niveaux de fluorescence dans (c) la rétine et le vitré, et (d) la chambre antérieure des souris C57Bl/6J, 5 à 60 min après l'injection sous-cutanée de 1 mg de fluorescéine. N = 5 à 6 souris pour les doses-réponses dans (a et b) et N = 3 souris pour les évolutions temporelles (c et d). R = rétine ; V = humeur vitrée ; AC = chambre antérieure ; SC = sous-cutané.

Dans une première expérience, nous avons utilisé des doses croissantes de 0,25, 0,5 et 1,0 mg de fluorescéine injectée SC, et après 30 minutes, nous avons effectué des scans de l'œil. Nous avons observé une augmentation dose-dépendante de la fluorescéine dans chaque compartiment, comme le montre le profil de balayage moyen (Fig. 2a), qui pourrait être quantifiée par les mesures de l'aire sous la courbe (AUC) des signaux fluorescents dans la rétine, le vitré et la chambre antérieure. (Fig. 2b). À partir de cette expérience, nous avons sélectionné la dose de 1 mg pour les expériences d'évolution dans le temps illustrées à la Fig. 2c, d, car cette dose était optimale pour la détection de la fluorescence dans les différents compartiments oculaires de la souris.

Nous avons ensuite surveillé l'accumulation de fluorescéine dans les différents compartiments oculaires toutes les 5 min, jusqu'à 60 min après l'injection. Dans le vitré (Fig. 2c) et la chambre antérieure (Fig. 2d), une élévation linéaire de la fluorescéine a été détectée. Dans la rétine, les niveaux de fluorescéine sont saturés environ 20 min après l'injection SC (Fig. 2c). Avec le dosage IV (Fig. 1 supplémentaire), des tendances similaires ont été observées par rapport au dosage SC dans la chambre antérieure et le vitré, mais les niveaux de fluorescéine dans la rétine ont culminé 5 min après l'administration et ont diminué au cours de l'expérience, probablement en raison d'une augmentation systémique. autorisation.

À la suite de ces expériences, nous avons décidé de continuer avec une dose de 50 mg/kg de fluorescéine, pour toutes les expériences ultérieures comme le montrent les Fig. 3, 4 et 5. La dose de 50 mg/kg se rapproche d'une dose totale de fluorescéine de 1 mg utilisée pour des expériences de cours de temps précédentes pour une souris d'environ 20 g. L'ajustement au poids corporel assure des niveaux plasmatiques de fluorescéine plus constants. De plus, pour les expériences restantes, les niveaux de fluorescéine dans les différents compartiments oculaires ont été normalisés aux valeurs plasmatiques et exprimés comme tels.

Application du fluorophotomètre de souris dans le modèle d'uvéite induite par l'endotoxine. Du LPS (1 ng) ou du PBS a été injecté par voie intravitréenne dans les yeux de souris C57Bl/6J, et 24 h plus tard, une fluorophotométrie, un OCT et une angiographie à la fluorescéine ont été réalisés sur des souris injectées avec 50 mg/kg de fluorescéine par voie sous-cutanée. ( a ) Angiographie à la fluorescéine représentative (panneaux supérieurs) et images OCT (panneaux inférieurs), à partir d'yeux de souris traités au PBS (à gauche) et au LPS (à droite) 50 minutes après l'administration de fluorescéine. La flèche dans l'image OCT de l'œil injecté de LPS montre la présence de cellules immunitaires infiltrantes dans le vitré. ( b – d ) Les cours du temps quantifiant les niveaux de fluorescéine dans ( b ) la rétine, ( c ) le vitré et ( d ) la chambre antérieure à l'aide de la fluorophotométrie n'ont révélé aucune différence significative dans les niveaux de fluorescéine dans la rétine et la chambre antérieure entre PBS et LPS traitement. Cependant, dans le corps vitré, une augmentation significative aux derniers moments de 45 à 60 min a été observée après le traitement au LPS. Les données présentées en (b–d) sont corrigées en fonction des taux plasmatiques de fluorescéine. ( e ) Les taux plasmatiques de fluorescéine n'étaient pas significativement différents entre les groupes de traitement PBS et LPS. Barres d'échelle = 500 µm. N = 5 à 8 yeux par point dans le temps. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, en utilisant l'ANOVA à deux facteurs avec des mesures répétées, suivie des comparaisons multiples de Bonferroni. Les données sont données sous forme de moyennes ± SEM. PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; LPS = lipopolysaccharide.

Quantification de la perméabilité dans le modèle de souris diabétique à la streptozotocine (STZ) par fluorophotométrie. Des souris qui avaient été induites avec STZ pour être diabétiques 10 semaines auparavant ont été utilisées dans cette expérience, et comparées à des animaux témoins non diabétiques du même âge. ( a ) Les taux de glucose sanguin étaient significativement élevés chez les souris diabétiques STZ, 10 semaines après l'induction du diabète, alors que ( b ) le poids corporel n'était pas significativement différent des souris témoins non diabétiques. Les niveaux de fluorescéine dans (c) la rétine, (d) le corps vitré et (e) la chambre antérieure ont tous augmenté de manière significative chez les souris STZ à différents moments de 40 à 60 min après l'injection de 50 mg/kg de fluorescéine sous-cutanée, par rapport avec des témoins non diabétiques. Les données présentées en (c–e) sont corrigées en fonction des taux plasmatiques de fluorescéine. ( f ) Les taux plasmatiques de fluorescéine n'étaient pas significativement différents entre les groupes de traitement de souris témoins diabétiques et non diabétiques STZ. N = 6 à 16 yeux par point dans le temps. Glycémie et poids corporel évalués statistiquement par ANOVA à deux voies avec des mesures répétées, suivies du test de comparaison multiple de Tukey. Fuite du compartiment oculaire évaluée statistiquement par ANOVA à deux voies avec mesures répétées, suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Les données sont données sous forme de moyennes ± SEM.

Quantification de la perméabilité dans le modèle de souris CNV spontanée JR5558 et réponse au traitement anti-VEGF mesurée par fluorophotométrie. ( a - c ) Des souris JR5558 mâles et femelles et des souris C57Bl / 6J témoins appariées selon l'âge ont reçu une injection sous-cutanée de 50 mg / kg de fluorescéine, et l'évolution dans le temps des rapports des niveaux de fluorescéine corrigés au plasma dans des compartiments oculaires séparés a été mesurée. Les souris JR5558 présentaient une augmentation significative des niveaux de fluorescéine dans (a) la rétine et (b) le vitré par rapport aux souris C57Bl/6J. Les niveaux de fluorescéine dans (c) la chambre antérieure et (d) le plasma n'étaient pas significativement différents. (e – g) Des souris JR5558 ont reçu au départ (jour 0) et au jour 3 par voie intrapéritonéale des anticorps de contrôle anti-VEGF ou IgG, et la fuite de fluorescéine a été quantifiée par fluorophotométrie au départ et au jour 7. Les niveaux de fluorescéine corrigés par rapport au plasma circulant ont été mesuré 45 min après l'administration sous-cutanée de fluorescéine. ( e ) Le traitement anti-VEGF a réduit de manière significative la quantité de fluorescéine dans le vitré à environ 77% de la ligne de base ( f ), alors que le contrôle des IgG n'a eu aucun effet significatif. ( g ) Images d'angiographie à la fluorescéine représentatives des yeux de souris JR5558 au départ (panneaux de gauche pour chaque groupe de traitement) et après le traitement (panneaux de droite pour chaque groupe de traitement) après un traitement IgG ou anti-VEGF. N = 3 à 6 yeux pour les cours temporels, N = 12 yeux par groupe pour les traitements IgG et anti-VEGF Barres d'échelle = 500 µm. Fuite du compartiment oculaire évaluée statistiquement par ANOVA à deux voies avec mesures répétées, suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni. Les concentrations de fluorescéine vitreuse corrigées à l'inclusion et après le traitement ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivi du test de comparaisons multiples de Newman Keul. Pourcentage de changement par rapport au départ évalué statistiquement par un test T non apparié. *P < 0,05, **P < 0,01. Les données sont données sous forme de moyennes ± SEM.

Après avoir sélectionné la dose et la voie d'administration de la fluorescéine, nous avons commencé à tester l'adéquation du fluorophotomètre de souris pour détecter les changements de perméabilité vasculaire dans les modèles de maladie. Le premier que nous avons étudié était l'uvéite induite par l'endotoxine (EIU), un modèle d'uvéite antérieure. L'endotoxine LPS a été injectée par IVT, pour induire une inflammation et une rupture de la barrière hémato-rétinienne, puis une angiographie à la fluorescéine, un OCT et une fluorophotométrie ont été réalisés 24 h plus tard (Fig. 3). Le traitement des yeux par le LPS a induit une fuite vasculaire observée par angiographie du fond d'œil à la fluorescéine, avec une augmentation concomitante de l'afflux de cellules inflammatoires, qui a pu être observée par imagerie OCT (Fig. 3a). En parallèle, nous avons effectué une fluorophotométrie, et chez les animaux traités avec du LPS, il semblait y avoir une absorption de fluorescéine plus lente entre 15 et 25 min dans la rétine par rapport aux souris injectées au PBS (Fig. 3b), mais cela n'a pas atteint la signification. De plus, à 30 min et plus tard, il n'y avait pas de différences significatives dans les niveaux de fluorescéine par rapport au groupe témoin PBS, comme c'était également le cas pour la chambre antérieure (Fig. 3d). En revanche, dans le compartiment vitré, nous avons observé des niveaux plus élevés de fluorescéine dans les yeux traités au LPS, qui ont atteint une signification après 45 min et se sont poursuivis jusqu'à 60 min (P <0, 05; Fig. 3c). Les niveaux de plasma après 60 min n'étaient pas significativement différents entre les groupes LPS et PBS (Fig. 3e), ainsi les différences de niveaux vitrés de fluorescéine étaient probablement indépendantes des modifications de l'exposition systémique.

Après la validation du fluorophotomètre de souris avec EIU, nous sommes ensuite passés au modèle de diabète de souris induit par la STZ, pour voir si des changements dans les fuites vasculaires liées à l'hyperglycémie chronique pouvaient être observés. Après induction du diabète, nous avons d'abord observé une hyperglycémie à 2 semaines chez les souris (données non présentées) qui est restée élevée jusqu'à au moins 10 semaines après l'injection de STZ (Fig. 4a). Les animaux ont continué à prendre du poids à la fois chez les souris témoins non diabétiques et chez les souris diabétiques STZ, mais à un rythme plus lent dans le groupe STZ, qui n'a pas atteint la signification (Fig. 4b).

Étant donné que la fluorophotométrie a révélé de faibles niveaux de détection dans les phases initiales des mesures après l'injection de fluorescéine, les niveaux de détection étaient moins cohérents et fiables. Par conséquent, nous avons éliminé les premiers points de temps après l'injection et n'avons inclus que des mesures de 40 à 60 min. Les niveaux de fluorescéine dans chaque compartiment oculaire étaient significativement différents de ceux des groupes témoins non diabétiques. Dans la rétine et la chambre antérieure (Figs. 4c et e), les niveaux de fluorescéine ont augmenté à partir de 50 min chez les souris diabétiques STZ, par rapport aux témoins non diabétiques. Dans le vitré, une élévation significative de la fluorescéine était apparente à tous les moments mesurés (Fig. 4d). La fluorescéine plasmatique a été réduite chez les souris STZ (Fig. 4f), mais les valeurs n'ont pas atteint la signification.

Dans une expérience de validation finale, nous avons utilisé le modèle murin JR5558 de vascularisation choroïdienne spontanée (CNV). La souris JR5558 a déjà été utilisée dans des études précliniques pour tester de nouvelles thérapies34,35, nous avons donc voulu utiliser ce modèle pour surveiller longitudinalement les réductions de perméabilité dans les mêmes yeux d'animaux après la neutralisation du VEGF. Initialement, nous avons comparé l'accumulation de fluorescéine chez les souris JR5558 et les souris témoins C57Bl/6J du même âge, pour voir comment la présence de CNV avait un impact sur les fuites. Nous avons utilisé des souris âgées de 13 semaines pour ces expériences, qui présentaient déjà des lésions très bien établies. Dans la rétine, la fluorescéine a augmenté entre 45 et 55 min après l'administration sous-cutanée de souris JR5558 (Fig. 5a), mais n'était pas significativement différente de C57BL/6J à 60 min. Dans le vitré, une élévation significative de la fluorescéine a été observée à des moments allant de 45 à 60 min (Fig. 5b). Pour la chambre antérieure, aucun changement significatif n'a été observé entre les souris C57Bl / 6J et JR5558 (Fig. 5c), et les taux plasmatiques ne différaient pas entre les souches de souris (Fig. 5d).

Pour examiner l'effet de la neutralisation du VEGF sur la fuite de CNV chez les souris JR5558, nous avons administré un contrôle IgG ou des anticorps anti-VEGF par voie intrapéritonéale deux fois à des souris JR5558 âgées de 8 semaines. L'accumulation de fluorescéine n'a été mesurée que dans le corps vitré car les niveaux de fluorescéine rétinienne étaient trop variables (en raison de la présence de lésions néovasculaires fuyantes qui ont créé des zones ponctuées de signal de fluorescéine très élevé) et la pathologie néovasculaire est absente dans la chambre antérieure. Les taux vitré de fluorescéine n'étaient pas significativement différents dans les groupes IgG et anti-VEGF au départ. Après le traitement, les taux de fluorescéine dans le corps vitré n'ont pas changé dans le groupe IgG, mais dans le groupe anti-VEGF, il y a eu une réduction significative de 25 % par rapport au départ (P <0, 05 ; Fig. 5e, g). Lorsque nous avons calculé le pourcentage de changement de chaque animal par rapport au départ, des effets similaires ont été observés, avec une réduction globale de 19 % dans le groupe anti-VEGF, contre une augmentation de 7 % dans les groupes témoins IgG (Fig. 5f). Prises ensemble, ces données montrent que le fluorophotomètre peut être utilisé chez la souris pour fournir des évaluations longitudinales des changements de perméabilité en réponse au traitement.

Ici, nous démontrons une méthode pour les mesures en temps réel des changements de perméabilité vasculaire, in vivo, dans l'œil de la souris. La méthode a été appliquée à des modèles murins de rétinopathie diabétique, d'uvéite et de néovascularisation choroïdienne, où des augmentations des fuites vasculaires ont été observées par rapport aux animaux témoins. Dans une dernière expérience, nous avons démontré qu'il est possible d'atténuer les niveaux élevés de fluorescéine en utilisant un traitement anti-VEGF, et montrons que les changements de perméabilité avant et après traitement peuvent être mesurés dans les mêmes yeux d'animaux.

Comme pour toute méthode, le succès peut être déterminé par l'utilisation optimale de la technologie. Avec le fluorophotomètre de souris, un certain nombre de facteurs doivent être pris en compte. Il est essentiel d'avoir un alignement précis de la tête optique du fluorophotomètre avec le centre de l'axe visuel de la souris, pour permettre un balayage cohérent pour des données reproductibles. Comme la machine est un dispositif optique, basé sur une excitation focalisée et une détection d'émission de lumière, il est important d'avoir un axe visuel aussi exempt d'interférences que possible. Un problème initial était que sous anesthésie, même avec une lubrification régulière, les yeux de souris sont susceptibles de développer des cataractes36, ce qui rend impossible l'enregistrement des niveaux de fluorescéine dans les tissus oculaires postérieurs. Nous avons trouvé que la solution consistait à appliquer des lentilles de contact sur l'œil de la souris après l'induction de l'anesthésie, ce qui empêchait la formation de cataracte. De plus, les lentilles de contact doivent être exemptes de résidus laissés par le séchage d'un fluide (par exemple du PBS) sur la surface de la lentille. Cela peut être résolu en rinçant les lentilles dans de l'eau ultra pure avant utilisation.

Également liée au maintien d'un axe visuel clair, la méthode peut être sensible aux lésions des tissus oculaires, par exemple des injections intravitréennes, ou des agents qui provoquent une inflammation. Nous avons constaté que dans nos expériences utilisant l'administration intravitréenne de LPS, nous devions titrer la dose de LPS et effectuer des injections intravitréennes à l'aide d'aiguilles émoussées de calibre 34 afin de minimiser l'incidence d'hémorragie vitréenne ou de cellules inflammatoires dans la chambre antérieure. La variabilité entre les différents lots de LPS a été observée, il était donc important d'utiliser les numéros de lot identiques dans la mesure du possible. Une dilatation constante des yeux était également impérative ; des agents dilatants ont été ajoutés après l'anesthésie, avec le même volume de tropicamide administré à chaque œil.

Dans nos expériences, nous avons testé la fluorescéine en tant que colorant, car elle est largement utilisée dans les études d'imagerie et de perméabilité, en plus d'avoir un profil d'innocuité favorable pour une utilisation répétée chez la souris. D'autres colorants avec des poids moléculaires différents peuvent être meilleurs dans les expériences de fluorophotométrie pour détecter les changements dépendant des fuites, mais sortent du cadre du manuscrit actuel. Nous avons principalement utilisé la voie d'administration sous-cutanée pour la fluorescéine, car elle s'est avérée la plus simple à réaliser, entraînant moins d'erreurs de dosage et réduisant le signal sur bruit par rapport à la voie intraveineuse. Une autre variable critique était le moment de l'administration de la fluorescéine aux animaux. Nous avons constaté que le dosage des animaux une fois qu'ils avaient été anesthésiés réduisait considérablement la variabilité de nos résultats, peut-être parce que les souris sous anesthésie sont statiques et peuvent avoir des taux métaboliques similaires.

La fluorophotométrie de souris présente des avantages clés par rapport à certaines techniques existantes pour mesurer la perméabilité, telles que le bleu d'Evan ou d'autres méthodes basées sur la perfusion. Premièrement, il n'est pas nécessaire de sacrifier l'animal pour effectuer le test, ce qui signifie que les animaux peuvent être potentiellement utilisés pour de multiples expériences. Cela favorisera la pratique des 3R (réduction, raffinement et remplacement) en recherche animale29. Deuxièmement, il est possible de surveiller la fuite vasculaire chez le même animal de manière longitudinale à l'aide de mesures répétées, permettant ainsi aux chercheurs de calculer les effets avant et après le traitement, ou le développement de la perméabilité au fil du temps dans des modèles de maladies oculaires. Troisièmement, la méthode peut également être utilisée en combinaison avec des méthodes plus établies pour la perméabilité, comme le bleu d'Evan, et couplée à des techniques d'imagerie telles que l'angiographie à la fluorescéine. De plus, puisque l'appareil est adapté à l'utilisation de la souris, cela signifie qu'il est possible de combiner des mesures de fuite avec une manipulation génétique ciblée dans l'espèce, pour rechercher des facteurs contribuant à la rupture de la barrière hémato-rétinienne. Un inconvénient cependant est qu'en raison des différences significatives dans l'anatomie et la physiologie oculaire et systémique, les résultats chez la souris doivent être pris avec prudence si vous essayez de comparer directement les valeurs de fuite absolues entre les espèces, y compris dans les études humaines.

En résumé, nous recommandons que le fluorophotomètre de souris puisse être utilisé dans des expériences où un axe visuel clair peut être maintenu. Les traitements ou les altérations génétiques qui entraînent par exemple des cataractes, un hyphéma ou une hémorragie vitréenne peuvent être mieux servis par des méthodes telles que le bleu d'Evan ou d'autres méthodes basées sur la perfusion. Cependant, si l'axe visuel peut rester clair, la fluorophotométrie de la souris peut être utilisée sur plusieurs points dans le temps parallèlement aux méthodes existantes et peut être utilisée en conjonction avec des méthodes basées sur l'imagerie comme l'angiographie à la fluorescéine, où une image oculaire peut être informative. De plus, si le chercheur souhaite comparer ses données avec des méthodes basées sur la perfusion, il peut toujours le faire, si nécessaire.

En conclusion, nous considérons le fluorophotomètre de souris comme un outil très utile à la fois pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments. Alors que la prochaine génération de thérapies pour la dégénérescence maculaire liée à l'âge humide et l'œdème maculaire diabétique émerge, il est clair que le fait de disposer des meilleurs outils aidera à identifier les médicaments qui interagissent avec de nouvelles voies, offrant la combinaison optimale de contrôle des fluides et de durabilité de l'effet du traitement. . Le fluorophotomètre de souris peut offrir une méthode supplémentaire pour aider à séparer les meilleurs nouveaux traitements.

Le tableau 1 montre des informations concernant la souche, l'âge, le sexe et le fournisseur pour les animaux utilisés dans les différentes expériences tout au long de l'étude.

Tous les animaux ont reçu de la nourriture et de l'eau à volonté, selon un cycle jour/nuit de 12 heures, dans un environnement à température contrôlée. Les expérimentations animales ont été approuvées par l'Office fédéral de la sécurité alimentaire et vétérinaire de la Suisse (références BS-2730 et BS-2734) et menées dans le strict respect de l'ordonnance fédérale suisse sur la protection et le bien-être des animaux, ainsi que selon les règles de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans les directives de recherche en ophtalmologie et en vision, et conformément aux directives ARRIVE.

Pour les injections intravitréennes (IVT) de lipopolysaccharides (LPS), les animaux ont été anesthésiés avec de l'isoflurane 3 %, O2 100 %. Pour toutes les autres expériences, les souris ont été anesthésiées en utilisant la combinaison sous-cutanée de médétomidine (Dorbene®, 0,5 mg/kg, Graeub AG, Berne, Suisse), de midazolam (5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach-Whylen, Allemagne) et de fentanyl ( Curamed®, 0,05 mg/kg, Actavis Switzerland AG, Regensdorf, Suisse). Pour les expériences de récupération, les souris ont ensuite été antagonisées avec une combinaison de buprénorphine (Bupaq®, 0,2 mg/kg, Streuli Pharma AG, Uznach, Suisse), d'atipémazole (Alzane®, 2,5 mg/kg, Graeub AG, Berne, Suisse) et de flumazénil (Anexate®, 0,5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach-Whylen, Allemagne).

Avant l'application IVT, une solution de LPS (Cat L6529 ; Sigma, Saint-Gall, Suisse) a été préparée dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS ; Life technologies, Suisse) à partir d'aliquotes congelées stockées à - 20 °C avec une concentration finale de 1 ng/1 µl. Les animaux ont été anesthésiés à l'isoflurane, et des gouttes d'anesthésique local (Novesin®; OmniVision, Suisse) et mydriatique (Tropicamide 0,5% SDU Faure, Théa Pharma SA, Schaffhouse, Suisse)) ont été appliquées. Les yeux ont été rincés avec de la povidone iodée 5 % (iso-Betadine® 5 %, MEDA-Pharma GmbH & Co.KG, Bad Hombourg, Allemagne), suivi de PBS stérile, puis avec une seringue Nanofil et une aiguille de calibre 34 connectée ( NF34BL-2) (tous deux World Precision Instruments International, Friedberg, Allemagne) 1 µl/oeil de LPS ou de PBS (témoin) a été injecté. Enfin, les animaux ont été replacés dans la boîte de logement pour la récupération.

Après 24 h, les souris ont été anesthésiées par anesthésie sous-cutanée, puis une angiographie à la fluorescéine (FA) et des images de tomographie en cohérence oculaire (OCT) de la rétine et du vitré ont été prises pour confirmer la présence de cellules inflammatoires infiltrantes. Après l'imagerie, les souris ont subi une fluorophotométrie.

Les animaux ont été divisés en deux groupes, recevant soit de la streptozotocine (STZ; 50 mg/kg de poids corporel, 7,5 mg/ml, préparée dans un tampon de citrate de sodium 0,05 M, pH 4,5) soit du PBS injecté par voie intrapéritonéale (IP) pendant cinq jours consécutifs. La STZ a été préparée et conservée au réfrigérateur au moins 30 minutes avant l'administration. Cinq jours après les dernières doses de STZ ou de PBS, la glycémie a été mesurée par ponction de la veine caudale à l'aide d'un système de surveillance de la glycémie AlphaTrak (Abbott Laboratories Inc USA, Alameda, CA) et de bandelettes de test (Alpha Trak2, Zoetis Schweiz, Zürich Suisse). Le développement du diabète a été défini comme une glycémie supérieure à 14 mmol/L (250 mg/dl). Les animaux avec des niveaux de glucose inférieurs à 250 mg/dl n'ont pas été réinjectés ou inclus dans l'étude. Le poids et la glycémie de l'animal ont été surveillés tout au long de l'étude, et seules les souris présentant une glycémie continuellement élevée ont été considérées comme diabétiques. Pour les mesures de fluorophotométrie, les animaux ont été mesurés 10 semaines après la STZ.

Des souris mâles et femelles JR555833 ont été utilisées tout au long des études. Pour les études d'évolution dans le temps et de traitement pharmacologique anti-VEGF, les animaux étaient âgés respectivement de 13 et 8 semaines. Pour les expériences de traitement médicamenteux, les souris ont subi une angiographie à la fluorescéine (FA) de base34 et une évaluation par fluorophotométrie la semaine 8 le jour précédant le dosage des anticorps, pour affecter les animaux à des groupes de traitement avec un nombre de lésions statistiquement égal (P> 0,05; test t non apparié) et les concentrations de fluorescéine dans différents compartiments oculaires. Des anticorps de contrôle anti-VEGF (B20-4.137) ou IgG ont été administrés IP un jour après la ligne de base, puis une dose répétée 3 jours plus tard (1 ml/100 g de poids corporel, 2 doses au total). Les données de FA et de fluorophotométrie ont été recueillies à nouveau une semaine après la dose initiale d'anticorps, pour comparer les effets avant et après traitement du contrôle anti-VEGF et IgG. Pour l'évaluation initiale et post-traitement des souris JR5558, le point de temps de 45 minutes a été sélectionné pour la fluorophotométrie.

Les mesures de fluorophotométrie ont été effectuées sur un fluorophotomètre oculaire à balayage (Fluorotron Master Research Mouse Edition; OcuMetrics, Inc., Mountain View, CA). Un protocole plus détaillé décrivant les méthodes utilisées dans ce manuscrit peut être trouvé dans la section des méthodes supplémentaires.

Pour nous assurer que les concentrations de fluorescéine mesurées dans nos expériences étaient dans la plage linéaire, nous avons exécuté une courbe standard de fluorescéine. Les courbes standard n'ont pas été utilisées pour le calcul des niveaux de fluorescéine dans les expériences ultérieures, car le fluorophotomètre fournit des mesures directes de la fluorescéine en ng/ml. La courbe standard a été réalisée dans des microcuvettes avec du PBS comme diluant, en utilisant le porte-microcuvette fourni par le fabricant. En utilisant cette courbe standard, une relation linéaire a été observée à mesure que la concentration de fluorescéine augmentait (R2> 0, 99; Fig. 6), indiquant que les changements dans les niveaux de fluorescéine observés dans nos expériences étaient dus à des différences dépendantes de la concentration.

Courbes standard de fluorescéine. Courbes standard pour la fluorescéine dans (A) PBS et (B) plasma. Les étalons de fluorescéine ont été préparés dans du PBS ou du plasma de souris, puis dilués davantage dans du PBS, avant que la concentration de fluorescéine (ng/ml) ne soit mesurée dans une microcuvette. Une analyse de régression a été effectuée, avec des statistiques présentées sur les graphiques de la figure.

Pour les expériences in vivo, les animaux ont été anesthésiés en utilisant une anesthésie sous-cutanée. Après l'anesthésie, les yeux ont été dilatés avec du tropicamide 0,5 % (Tropicamide 0,5 % SDU Faure, Théa Pharma, Schaffhouse, Suisse), puis 5 min plus tard une solution de fluorescéine (cat 46 960 ; Sigma-Aldrich, St Gallen, Suisse) ou FITC-dextran 70 kDa ( cat 46 945; Sigma-Aldrich, St Gallen, Suisse) a été administré soit par voie IV, IVT ou SC, aux doses décrites dans les sections de résultats. Pour des résultats plus cohérents, nous avons observé qu'il était préférable d'administrer de la fluorescéine après l'anesthésie.

Après injection de fluorescéine, des lentilles de contact planes de 3,2 mm (Cantor et Nissel, Northamptonshire, Royaume-Uni) ont été placées sur les yeux de la souris. Les lentilles de contact sont utilisées pour empêcher le dessèchement, ce qui peut entraîner la formation de cataractes. Les animaux ont ensuite été placés sur une platine à température contrôlée (37°C) et les yeux alignés parallèlement au dispositif optique. Des scans oculaires ont été enregistrés à partir des yeux gauche et droit en utilisant une excitation de 450–490 nm et une détection d'émission de 520–600 nm, aux points temporels indiqués dans chaque section de résultats. Les scans oculaires prenaient environ 20 s par scan.

Dans certains cas, après fluorophotométrie, des échantillons de sang (25 µl) ont été prélevés dans la veine caudale pour la préparation du plasma (Microvette CB 300K2E ; Sarstedt AG, Allemagne) afin de normaliser les scans à la fluorescéine circulante, afin de tenir compte des différences d'administration potentielles. Les échantillons de sang ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 10 min, puis 10 µl du plasma résultant ont été dilués dans 990 µl de PBS dans une microcuvette à l'abri de la lumière (PS Micro Photometer Cuvette 2 ml ; LP Italiana, Milan, Italie) et scannés sur le Machine Fluorotron utilisant le porte-cuvette fourni, utilisant également une excitation de 450 à 490 nm et une détection d'émission de 520 à 600 nm.

Pour quantifier les mesures de fluorophotométrie, les données brutes ont été exportées au format txt. fichiers, puis tracés à l'aide de Microsoft Excel. L'aire sous la courbe moyenne (AUC) a été calculée pour 5 étapes dans chacune des régions des scans correspondant aux pics de la rétine, du vitré et de la chambre antérieure, tels que déterminés par des expériences sur le compartiment oculaire (Fig. 1). Les données non normalisées à la fluorescéine plasmatique sont exprimées en ng/ml de fluorescéine ± SEM.

Pour la normalisation plasmatique, la fluorescéine circulante a été calculée en faisant la moyenne des valeurs maximales maximales des analyses en double. Les taux de fluorescéine dans les compartiments oculaires ont ensuite été exprimés sous forme de rapport à la fluorescéine plasmatique, en divisant les moyennes brutes de l'ASC par les valeurs plasmatiques. Les données sont exprimées en tant que rapport moyen ± SEM du compartiment oculaire:fluorescéine plasmatique ng/ml.

Les données brutes ont été exportées du fluorophotomètre dans des fichiers .txt et copiées dans Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA). Le traitement et l'analyse ont été effectués à l'aide du logiciel Excel et GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Pour la comparaison statistique de seulement deux groupes, un test t non apparié a été utilisé. L'ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Newman Keul a été utilisée pour les comparaisons de 3 groupes ou plus. Pour les données temporelles, une analyse de variance à deux facteurs ANOVA (alpha 0,05) avec des mesures répétées, suivie de tests de comparaison multiples ont été utilisés (voir les légendes des figures pour plus de détails). Les valeurs aberrantes ont été supprimées avant l'analyse statistique à l'aide des critères de Chauvenet, les valeurs aberrantes étant définies comme étant ± 2 × écarts-types de la moyenne. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM avec *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier Bruce Ishimoto, premièrement pour le prêt initial d'une version prototype de l'appareil Fluorotron Master Mouse Edition, mais aussi pour ses conseils techniques et son assistance. Ce manuscrit est dédié au professeur David Shima.

Découverte en ophtalmologie, recherche pharmaceutique et développement précoce, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche SA, Bâle, Suisse

Nadine Colé, Janina Thoele, Christoph Ullmer & Richard H. Foxton

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NC : conception de l'étude, analyses de données et statistiques, travail in vivo, examen et rédaction de manuscrits ; JT : conception de l'étude, travail in vivo, examen et rédaction du manuscrit ; UC : révision et rédaction de manuscrits ; RF : conception de l'étude, analyses de données et statistiques, travail in vivo, révision et rédaction de manuscrits. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Richard H. Foxton.

NC, JT, CU, RF étaient tous des employés de F. Hoffmann-La Roche Ltd au moment où ces expériences ont été menées.

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Réimpressions et autorisations

Colé, N., Thoele, J., Ullmer, C. et al. Mesures en temps réel de la perméabilité vasculaire dans l'œil de la souris à l'aide de la fluorophotométrie vitreuse. Sci Rep 13, 9226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 31 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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