Le traitement des champignons entomopathogènes modifie la diversité bactérienne intestinale des tiques Rhipicephalus microplus

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 185 (2023) Citer cet article

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Les tiques sont des parasites suceurs de sang obligatoires responsables de pertes économiques importantes et de problèmes de santé humaine et animale, principalement en raison de la transmission d'agents pathogènes. Les champignons entomopathogènes ont été intensivement étudiés comme une stratégie alternative pour le contrôle des tiques qui peut être utilisée en combinaison avec des acaricides synthétiques dans la gestion intégrée des tiques. Ici, nous avons étudié comment la communauté bactérienne intestinale de Rhipicephalus microplus est façonnée après le traitement par Metarhizium anisopliae et comment la sensibilité des tiques au champignon est affectée après la perturbation du microbiote bactérien intestinal.

Des tiques femelles partiellement engorgées ont été nourries artificiellement avec du sang bovin pur ou du sang plus tétracycline. Deux autres groupes ont reçu le même régime alimentaire et ont été traités par voie topique avec M. anisopliae. Les intestins ont été disséqués et l'ADN génomique a été extrait 3 jours après le traitement ; la région variable V3–V4 du gène bactérien de l'ARNr 16S a été amplifiée.

L'intestin des tiques qui n'ont reçu aucun antibiotique mais qui ont été traitées avec M. anisopliae présentait une diversité bactérienne plus faible et une occurrence plus élevée d'espèces de Coxiella. L'indice de diversité de Simpson et le coefficient d'égalité de Pielou étaient plus élevés dans la communauté bactérienne intestinale lorsque les R. microplus étaient nourris avec de la tétracycline et traités avec des champignons. Les tiques des groupes traités aux champignons (avec ou sans tétracycline) ont présenté une survie plus faible que les femelles non traitées. L'alimentation antérieure des tiques avec l'antibiotique n'a pas modifié leur sensibilité au champignon. Ehrlichia spp. n'ont pas été détectés dans les groupes gueated.

Ces résultats suggèrent que l'action myco-acaricide ne serait pas impactée si le veau hébergeant ces tiques était sous antibiothérapie. De plus, l'hypothèse selon laquelle les champignons entomopathogènes peuvent affecter la communauté bactérienne dans l'intestin des femelles gorgées de R. microplus est confirmée par le fait que les tiques exposées à M. anisopliae ont présenté une réduction spectaculaire de la diversité bactérienne. Il s'agit du premier signalement d'un champignon entomopathogène affectant le microbiote intestinal des tiques.

L'importance du microbiome des tiques avec une signification médicale et vétérinaire a été de plus en plus reconnue ces dernières années [1,2,3]. La plupart de ces études sont motivées par l'importance de comprendre les maladies transmises par les tiques pour améliorer leur contrôle. En tant qu'ectoparasites obligatoires suceurs de sang, les tiques doivent compter sur des endosymbiontes pour la supplémentation nutritionnelle [4,5,6]. Rhipicephalus microplus, considérée comme la tique la plus répandue dans les zones tropicales [7], est une espèce de tique à hôte unique qui parasite préférentiellement le bétail, causant de grandes pertes économiques dans le bétail principalement en raison de la transmission d'hémoparasites tels que Babesia bovis, Babesia bigemina et Anaplasme marginal [8, 9].

Les traitements antibiotiques ont été utilisés soit sur des hôtes vertébrés, soit directement dans les tiques par alimentation artificielle ou injection pour comprendre le rôle du microbiome intestinal dans la biologie des tiques et des maladies transmises par les tiques [10,11,12]. Il a été démontré que la composition du microbiote intestinal d'une tique pouvait affecter l'acquisition, la colonisation et la transmission d'agents pathogènes transmis par les tiques [13]. Lorsque le microbiote intestinal a été altéré chez Ixodes scapularis, la colonisation de Borrelia burgdorferi a été réduite [11]. Néanmoins, le contraire est également suggéré de se produire. Adegoke et al. [14] ont démontré que lorsque R. microplus était infecté par un apicomplexe, Theileria sp., le microbiome intestinal était altéré et sa diversité, sa richesse en espèces et sa régularité étaient inférieures à celles des tiques non infectées.

Les applications d'acaricides synthétiques sont généralement la méthode de choix pour lutter contre les tiques, mais ont soulevé des inquiétudes concernant la santé humaine, animale et environnementale et ont conduit à l'émergence de populations de tiques résistantes [15]. L'utilisation de champignons entomopathogènes est une alternative prometteuse dans la recherche d'une méthode plus sûre et plus durable de lutte contre les tiques [16]. Le genre fongique entomopathogène Metarhizium comprend plusieurs espèces qui comptent parmi les biopesticides les plus explorés et les plus utilisés avec succès en agriculture [17], avec le potentiel d'être utilisés commercialement contre les tiques. Les spores fongiques infectent les tiques au contact et peuvent être utilisées dans la lutte intégrée contre les ravageurs, réduisant ainsi la surutilisation des acaricides synthétiques, selon des études antérieures [16, 18, 19]. Malgré cela, il reste beaucoup à examiner pour bien comprendre les interactions tiques-champignons, en particulier en ce qui concerne les réponses immunitaires et biochimiques des tiques infectées par des champignons [20,21,22,23,24,25]. À notre connaissance, il n'existe aucun rapport établissant un lien entre les bactéries intestinales des tiques et l'action des entomopathogènes fongiques. Le microbiote de la tique pourrait-il influencer sa sensibilité aux champignons entomopathogènes ? Chez les insectes, la réponse semble dépendre de l'hôte : pour le moustique Anopheles stephensi et le coléoptère Dendroctonus valens, le microbiote de l'hôte a positivement contribué à l'action fongique [26, 27], ce qui n'a pas été démontré pour la blatte germanique Blattella germanica [28] .

Par exemple, ce que l'on sait des interactions du microbiome des tiques est principalement lié à sa physiologie et aux impacts sur la biologie des maladies transmises par les tiques. La première description de la diversité bactérienne de R. microplus remonte à 2011 par Andreotti et al. [29], et plus récemment, les auteurs ont décrit davantage de découvertes selon différentes localisations géographiques [30]. Dans la présente étude, nous avons cherché à explorer comment les étapes initiales de l'infection fongique entomopathogène, après un traitement topique, peuvent déclencher des changements de la communauté bactérienne intestinale chez R. microplus et si la perturbation de la communauté bactérienne intestinale a un impact sur la sensibilité de cette tique aux champignons entomopathogènes.

Un veau a été artificiellement infesté de larves de R. microplus (souche Porto Alegre) (Reck et al. [15] et détenu à la station de recherche parasitologique WO Neitz de l'Université rurale fédérale de Rio de Janeiro (UFRRJ), Brésil (CEUA [Ethics Comité sur l'utilisation des animaux]/Institut vétérinaire, UFRRJ—protocole n° 9714220419). Les tiques ont été nourries naturellement sur le veau pendant 19 ou 20 jours, puis retirées manuellement en les détachant soigneusement de la peau de l'hôte (pour éviter de perturber les pièces buccales ). Le veau utilisé n'était pas sous traitement antibiotique ou acaricide depuis 2 mois avant l'expérience. L'alimentation artificielle de R. microplus a été adaptée de Valim et al. [31] et Ribeiro et al. [32]. Les femelles tiques partiellement engorgées ont été pesées. , stérilisé en surface avec de l'hypochlorite de sodium (0,05 % v/v) pendant 3 min et séché avec des serviettes en papier. Le sang utilisé pour nourrir artificiellement les tiques a été directement prélevé dans la veine jugulaire du même veau (CEUA/Institut vétérinaire, UFRRJ—protocole n° 6407270619) où les tiques étaient alimentées naturellement à travers un système de vide dans un tube de 3,6 ml contenant du citrate comme anticoagulant (Vacuplast, Turquie). Des femelles de tiques pesant environ 30 à 70 mg ont été nourries artificiellement avec du sang pur ou du sang plus du chlorhydrate de tétracycline (Merck, Darmstadt, DE) à 0,05 mg ml-1 pendant 7 h à l'aide d'embouts en plastique à 37 ± 1 ° C et ≥ 80% d'humidité relative (RH). Les pointes ont été remplies individuellement de sang (jusqu'à 50 µl) toutes les heures, autant que nécessaire. Les femelles partiellement engorgées ont été autorisées à se nourrir avec une moyenne de 350 µl de sang au maximum. Les tiques ont été pesées individuellement avant et après l'alimentation artificielle pour mesurer l'absorption de sang. Seules les tiques ayant doublé leur poids initial ont été prises en compte pour une analyse plus approfondie (0,03 µg de tétracycline mg−1 poids femelle) [12].

L'isolat fongique Metarhizium anisopliae sensu stricto LCM S04 [19] a été utilisé dans la présente étude. Les cultures ont été cultivées sur un milieu d'avoine dans des conditions contrôlées (25 ± 1 °C ; ≥ 80 % HR) pendant 21 jours. Les conidies ont été mises en suspension dans une solution d'eau distillée stérile avec du monooléate de polyoxyéthylène sorbitan (Tween® 80) (Isofar, Rio de Janeiro, Brésil) 0,01 % (v/v) à 1 × 108 conidies ml−1. La viabilité fongique a été évaluée en étalant une aliquote de 20 µl de 1 × 105 conidies ml-1 de la même suspension fongique sur de la gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) (Kasvi, Paraná, Brésil). La germination des conidies a été déterminée 24 h après incubation à 25 ± 1 °C et HR ≥ 80 % à l'aide d'un microscope optique (×400) (ECLIPSE E200 ; Nikon, Tokyo, Japon). Un minimum de 300 conidies a été évalué et le pourcentage de germination a été calculé. Les conidies étaient considérées comme germées lorsque le tube germinatif était visible. Les suspensions fongiques utilisées dans les expériences avaient une viabilité d'au moins 95 %. Comme la présente étude a accédé au patrimoine génétique brésilien, la recherche a été enregistrée auprès du Système national de gestion du patrimoine génétique et des savoirs traditionnels associés (SisGen) sous le code AA47CB6.

Des tiques nourries artificiellement avec du sang pur ou du sang plus tétracycline (section "Alimentation artificielle des femelles Rhipicephalus microplus") ont été traitées par voie topique avec une suspension de M. anisopliae. Quatre groupes de 10 femelles chacun ont été constitués comme suit : tiques non traitées nourries avec du sang pur (groupe contrôle) (ctrl) ; des tiques non traitées nourries avec du sang et de la tétracycline (T) ; tiques traitées aux champignons préalablement nourries avec du sang pur (F); tiques traitées aux champignons préalablement nourries avec du sang et de la tétracycline (T + F). Dès que l'alimentation artificielle était terminée, les tiques étaient lavées à l'eau du robinet pour éliminer tout résidu de sang, séchées et pesées. Ensuite, les tiques qui avaient doublé de poids ont été fixées avec du ruban adhésif dans des boîtes de Pétri à l'aide de ruban adhésif double face et traitées par voie topique avec 20 µl de 1 × 108 conidies ml-1. La suspension a été appliquée sur la région dorsale de la tique et les tiques ont été maintenues à 25 ± 1 °C et HR ≥ 80 %. Soixante-douze heures après le traitement fongique, les tripes de trois femelles de chaque groupe ont été disséquées pour l'extraction d'ADN. La survie des autres tiques a été enregistrée quotidiennement pendant 15 jours. Ce bioessai a été réalisé trois fois avec de nouveaux lots de conidies et de tiques R. microplus.

Les intestins des femelles de R. microplus ont été disséqués avec des pincettes stériles et des lames de scalpel en utilisant une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) [NaCl 130 mM, KH2PO4 1 mM, Na2HPO4 5,6 mM, KCl 2 mM (pH 7,2)]. Les tissus intestinaux retirés ont été lavés deux fois dans du PBS stérile et conservés ultérieurement dans de l'ARN (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) à -80 ° C jusqu'à l'extraction. Tout d'abord, les boyaux de tiques ont été congelés dans de l'azote liquide et macérés avec un pilon stérile. L'ADN de l'homogénat intestinal a été extrait en suivant le protocole du kit DNeasy Blood & Tissue selon les instructions du fabricant (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). L'ADN du sang du veau (B) utilisé pour l'alimentation naturelle et artificielle a également été extrait selon le même protocole mentionné ci-dessus.

La région variable V3–V4 du gène bactérien de l'ARNr 16S a été amplifiée pour l'ADN génomique de 13 échantillons (triplicats d'échantillons intestinaux de chaque groupe et un pour le contrôle sanguin [B]), en utilisant les amorces Bakt_341F (CCTACGGGNGCWGCAG) et Bakt_805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) [33]. L'ADN polymérase Herculase II Fusion (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) et le Nextera XT Index Kit v2 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) (300 paires de bases [pb] appariées -end reads) ont été utilisés sur la plateforme Illumina® MiSeq® avec un pic PhiX de 30 % sur Macrogen (Séoul, Corée du Sud). Les appels de base binaires ont été convertis au format FASTQ, les séquences ont été démultiplexées et les codes-barres ont été supprimés à l'aide du package bcl2fastq v2.20 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA).

Les adaptateurs ont été supprimés des données brutes (1 250 293 séquences avant et arrière), qui ont ensuite été filtrées en fonction des scores de qualité et ajustées à l'aide de DADA2 Pipeline version 1.16 [34] dans R version 4.1.1 (R Core Team 2022) en conjonction avec RStudio 1.4.1717 (Équipe RStudio 2022) [35]. L'outil FIGARO [36] a été utilisé pour calculer les paramètres de troncature optimisés. Les lectures directes et inverses ont été tronquées à 270 pb et 215 pb, respectivement. Les lectures directes et inverses avec plus de deux erreurs attendues ont été rejetées, respectivement, et les lectures ont été tronquées à la première instance d'un score de qualité ≤ 2. Les taux d'erreur de lecture ont été appris par la fonction "learnErrors", alternant entre l'estimation du taux d'erreur et l'échantillonnage. inférence jusqu'à convergence. Les variants de séquence d'amplicon (ASV) ont été déduits à l'aide de la fonction "donnée", et les séquences ont été fusionnées par la fonction "mergePairs". Les chimères ont été supprimées des collections de séquences uniques par la méthode de consensus entre les échantillons en utilisant la fonction "removeBimeraDenovo". Les affectations taxonomiques T ont été données sur la base de la base de données modifiée SILVA SSU 132 [37] en utilisant la fonction "IdTaxa" du package DECIPHER v 2.20 R [38], une méthode avec des performances de classification meilleures que la méthode standard du classificateur bayésien naïf [ 39]. Les séquences attribuées au génome mitochondrial, aux chloroplastes et aux non-bactéries ont été supprimées. Après ces procédures, 3 313 ASV ont été attribués aux 839 263 séquences bactériennes restantes pour la procédure de raréfaction et l'analyse statistique.

La courbe de survie des tiques a été analysée par un test de log-rank avec un niveau de signification de 0,05 à l'aide de GraphPad Prism version 8.4.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Toutes les autres analyses statistiques ont été effectuées dans la version 4.1.1 du logiciel R (R Development Core Team, Vienne, Autriche) en conjonction avec RStudio 1.4.1717 (Posit Software, Boston, MA).

Des analyses exploratoires multivariées ont été réalisées à l'aide du package R "vegan" version 2.5-7 [40]. La diversité bêta a été étudiée sur la base de l'analyse des coordonnées principales (PCoA) à l'aide de la matrice de distance UniFrac pondérée des communautés microbiennes dans chaque échantillon, montrant les différences entre les communautés bactériennes de différents traitements. La prédominance des VAS rares, spécialistes et généralistes a été évaluée par la méthode de classification multinomiale des espèces (CLAM) avec ajustement pour les comparaisons multiples, en utilisant le seuil de spécialisation de la supermajorité (K = 2/3, P = 0,05) [41]. Les graphiques ont été construits avec le package ggplot2 R version 3.3.3 [42].

L'analyse du réseau entre les ASV a été évaluée à l'aide d'estimations bootstrap de la corrélation SparCC par le package SpiecEasi R version 1.1.0, résultant en des matrices de nœuds et de bords [43]. Seules les arêtes avec des corrélations significatives (P < 0,01) ont été sélectionnées pour la construction graphique à l'aide du logiciel Gephi version 0.9.2 [44], mettant en évidence le nombre de connexions (degré), la centralité intermédiaire (BC) et le signe des corrélations.

La survie des tiques dans le groupe ctrl était supérieure à celle des groupes F (χ2 = 81,9, P < 0,0001) et T+F (χ2 = 68,4, P < 0,0001), mais n'était pas différente du groupe T (χ2 = 0,06, P = 0,80). Les survies F et T+F étaient similaires (χ2 = 0,5, P = 0,47) (Fig. 1). Les tiques des deux groupes traités au champignon (avec et sans tétracycline) étaient mortes (0 % de survie) dans les 12 jours. Dans le même temps, les groupes de champignons non traités (ctrl et T) ont présenté une survie moyenne de 85 %. Aucune différence de survie n'a été observée entre les tiques nourries artificiellement avec de la tétracycline (T) ou non (ctrl).

Survie des femelles Rhipicephalus microplus après gavage artificiel avec ou sans traitement à la tétracycline et Metarhizium anisopliae (moyenne et erreur standard). L'astérisque indique une différence statistique entre ctrl et T+F (P < 0,05) par test de rang long. Traitements : ctrl - tiques non traitées avec des champignons et préalablement nourries avec du sang pur (groupe témoin) ; T - tiques non traitées avec des champignons préalablement nourries avec du sang et de la tétracycline ; F - tiques traitées aux champignons préalablement nourries avec du sang pur ; T + F - tiques traitées aux champignons précédemment nourries avec du sang et de la tétracycline

La PCoA, basée sur la matrice de distance UniFrac pondérée, expliquait environ 77 % de la variance totale du modèle multivarié uniquement sur les deux axes principaux (Fig. 2A). Par ce paramètre, la communauté bactérienne intestinale des tiques nourries avec de la tétracycline et traitées avec M. anisopliae (T+F) différait des autres niches. L'intestin des tiques nourries avec du sang et de la tétracycline sans traitement fongique (T) ou nourries avec du sang pur et traitées avec un champignon (F) présentait des structures de communautés bactériennes relativement proches les unes des autres. Les communautés du premier groupe (ie, T) étaient également proches de celle observée dans l'intestin des tiques du groupe ctrl (tiques nourries avec du sang pur). La communauté bactérienne du sang de veau (B) était la plus distincte.

Structure et diversité alpha des communautés bactériennes dans les intestins et le sang de veau de Rhipicephalus microplus. Une analyse de la diversité bêta communautaire basée sur PCoA, basée sur la matrice pondérée par la distance UniFrac pour les ASV, montrant les différences entre les groupes. B Nombre d'ASV uniques. Indice de diversité de C Shannon. Indice de diversité de D Simpson. E Coefficient d'égalité de Pielou. Les points indiquent l'emplacement exact des moyens. B–E Les traitements dont les moyennes sont suivies des mêmes lettres minuscules en exposant ne diffèrent pas les uns des autres par le test de différence honnêtement significative (HSD) de Tukey à un seuil de signification de 5 %. Les désignations de groupe sont données dans la Fig. 1

Les traitements présentaient des nombres moyens similaires d'ASV bactériennes dans les analyses de la diversité bêta (Fig. 2B). En accord avec le résultat PCoA, l'indice de diversité de Shannon (Fig. 2C), la diversité de Simpson (Fig. 2D) et le coefficient d'égalité de Pielou (Fig. 2E) [45, 46] mesurés dans l'intestin de T+F étaient les plus élevés et différaient significativement de ceux observés dans les autres traitements, à l'exception de l'indice de Shannon, où T n'était pas différent de T+F. Dans l'ensemble, F présentait les indices les plus bas de diversité bactérienne intestinale, suivi de B, ctrl, T, jusqu'à culminer à T+F.

Le profilage taxonomique a généré 839 263 séquences bactériennes filtrées de qualité classées en 3313 ASV. La couverture de la classification ASV dans les rangs taxonomiques était la suivante : phylum (96 %), classe (94 %), ordre (86 %), famille (75 %), genre (49 %) et espèce (5 %). Les 19 familles les plus abondantes représentaient plus de 80 % du total des familles (Fig. 3A). Dans tous les traitements, les familles les plus abondantes (plus de 2 % du total des ASV) étaient les Coxiellaceae (43,9 % des séquences), suivies des Anaplasmataceae (8,1 %), des Lachnospiraceae (4,9 %), des Ruminococcaceae (3,3 %), des Comamonadaceae (3,0 % ), et Bacteroidacées (2,6%).

Composition des familles bactériennes A prédominantes et des genres B dans les intestins et le sang pur des tiques (B). Les échantillons ont été regroupés sous forme de dendrogrammes en fonction de la distance calculée à l'aide du coefficient de corrélation de Spearman. Les désignations de groupe sont données dans la Fig. 1

Suivant les familles, les 19 genres les plus abondants représentaient plus de 80% du total des genres (Fig. 3B). Les genres les plus abondants (plus de 1 % du total des ASV) étaient Coxiella (43,9 %), Anaplasma (6,3 %), Bacteroides (2,6 %), Streptococcus (1,9 %), Ehrlichia (1,8 %), Caviibacter (1,7 %), Eubacterium (1,5 %), Lactobacillus (1,1 %) et Pseudomonas (1,1 %). À l'exception des ASV attribués à Anaplasma et Ehrlichia, tous deux de la famille des Anaplasmataceae, tous ces genres étaient représentatifs de familles différentes.

Selon le coefficient de corrélation de Spearman, à l'appui des résultats de la PCoA (Fig. 2A), les compositions des familles bactériennes (Fig. 3A) et des genres (Fig. 3B) en B et dans l'intestin des tiques de T + F différaient de celles observées dans le d'autres traitements, en particulier ctrl. Alors que dans les autres traitements (c.-à-d. ctrl, T et F), les bactéries de Coxiellaceae, principalement référables à Coxiella, étaient prédominantes, les intestins T + F présentaient une prédominance d'espèces de Lachnospiraceae, suivies d'espèces de Comamonadaceae et de Ruminococcaceae. De plus, les données provenant des intestins du traitement T+F présentaient un groupe de plusieurs autres familles bactériennes avec des fréquences d'occurrence inférieures à 0,5 %. En B, les Anaplasmataceae (principalement du genre Anaplasma) étaient prédominantes, suivies des Bartonellaceae (principalement attribuées à Bartonella).

Selon la méthode de classification multinomiale des espèces (CLAM), un enrichissement jusqu'au niveau de la classe bactérienne a été observé (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1). En général, les bactéries de la classe Gammaproteobacteria étaient prédominantes dans tous les traitements. Selon le CLAM, les contrastes avec le ctrl indiquaient un enrichissement des Bacilles et des Clostridies en F (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1A), des classes de Clostridia et d'Actinobactéries en T+F (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1B), et des Alphaprotéobactéries et des Bacilles en B (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1C). Un enrichissement jusqu'au niveau générique a également été observé, opposant l'occupation de la niche de chaque traitement au ctrl (Fig. 4). Selon la comparaison, les groupes enrichis (bactéries spécialistes) du groupe ctrl ont varié, avec une prédominance de Faecalibacterium, Anaplasma et Streptococcus (Fig. 4).

Méthode de classification multinomiale des espèces (CLAM) pour le test d'occupation des niches. Les genres bactériens ne sont indiqués que dans des cercles qui se détachent de manière significative dans chaque habitat. Les généralistes (gris), les spécialistes (orange, bleu, vert, rose et violet) et les rares (noir) sont indiqués avec leurs pourcentages respectifs. Les valeurs en pourcentage représentent le nombre direct d'ASV uniques dans chaque niche. AT contre ctrl ; BF contre ctrl ; C T+F contre ctrl ; D sang contre ctrl. Les désignations de groupe sont données dans la Fig. 1

Les intestins du groupe T présentaient un enrichissement significatif en bactéries spécialisées (51, 4%), mettant en évidence les ASV associés à Staphylococcus, Corynebacterium, Anaplasma et d'autres espèces de Lachnospiraceae (Fig. 4A). Dans les intestins des femelles traitées aux champignons (F), les bactéries spécialisées représentaient 43 % du total des ASV, avec Cutibacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Ruminococcus, Faecalibacterium et d'autres ASV des familles Lachnospiraceae et Ruminococcaceae se démarquant (Fig. 4B ). Les intestins de T+F présentaient des espèces bactériennes spécialisées limitées à seulement 27,6 %, soulignant l'enrichissement des genres Enterococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Anaerostipes, Phascolarctobacterium, Eggerthella et d'autres associés aux familles Lachnospiraceae, Xanthobacteraceae et Moraxellaceae (Fig. 4C). Les communautés bactériennes du sang de veau (B) et des intestins de tiques nourries exclusivement de sang (ctrl) ont également été comparées, ce qui indique une prédominance de spécialistes à des taux de 29,9 % et 58,1 %, respectivement (Fig. 4D). Dans ce cas, un enrichissement significatif en ASV associés aux genres Cutibacterium, Faecalibacterium et Corynebacterium a été observé dans le sang par rapport au ctrl.

L'analyse de cooccurrence des ASV a révélé des espèces clés (espèces clés) qui maintenaient les communautés bactériennes dans les différents échantillons étudiés (Fig. 5, Tableau 1). Les communautés bactériennes intestinales des tiques non traitées (ctrl) étaient principalement reliées par deux espèces clés des genres Ehrlichia et Coxiella. Quatre ASV associés aux genres Cutibacterium, Faecalibacterium, Caviibacter et Bacteroides ont également joué un rôle (Fig. 5A). Ce réseau avait 83 nœuds, 1446 bords et 68,19 % d'interactions positives (tableau 1).

Analyse de co-occurrence en réseau des communautés bactériennes dans les intestins de Rhipicephalus microplus traités ou non avec Metarhizium anisopliae basé sur le gène ARNr 16S. La taille des nœuds est proportionnelle au degré et les couleurs indiquent des intervalles discrets de centralité intermédiaire (BC). Les désignations de groupe sont données dans la Fig. 1

La communauté bactérienne de T avait la plus grande complexité de réseau (nœuds = 106, arêtes = 3251, corrélations positives = 54,57%). Les espèces clés étaient associées à un ASV de Caviibacter, suivi de Coxiella et, dans une moindre mesure, de Cloacibacterium, Bacteroides et d'autres espèces des familles Lachnospiraceae et Peptostreptococcaceae (Fig. 5B, Tableau 1).

Le réseau de F a montré la deuxième complexité la plus élevée (nœuds = 97, arêtes = 2185, corrélations positives = 67, 19%), mettant en évidence comme espèces clés deux ASV du genre Coxiella, suivis de Staphylococcus, Streptococcus et Actinomyces (Fig. 5C, Tableau 1). Chez les tiques nourries avec de la tétracycline et traitées avec des champignons (T+F), la complexité du réseau et le nombre de corrélations positives étaient plus faibles (nœuds = 74, arêtes = 1247, corrélations positives = 44,03 %) par rapport à ceux observés dans le seul traitements (ctrl, T ou F) (Fig. 5D). Dans le cas des tiques nourries à la tétracycline et traitées au champignon (T+F), plusieurs ASV avaient des centralités et des degrés de connexion similaires. Cela met en évidence la participation de nombreux genres, notamment Lactobacillus, Eubacterium, Colidextribacter, Prevotella, Trueperella, Campylobacter et Phascolarctobacterium.

Comme attendu, le réseau de la communauté bactérienne du sang de veau (B) était le moins complexe (nœuds = 38, arêtes = 140, corrélations positives = 48,57 %). Ce réseau était régulé par plusieurs ASV, principalement ceux associés à Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia/Shigella, Bacteroides, Bartonella, Lactobacillus, Anaplasma et Mycoplasma, ainsi qu'un ASV associé à la famille des Lachnospiraceae (Fig. 5E).

Les antibiotiques jouent un rôle crucial dans le traitement des maladies infectieuses telles que la mammite clinique [47] et les maladies transmises par les tiques [48], et ils peuvent être utilisés comme promoteurs de croissance [49]. Néanmoins, l'impact de l'administration d'antibiotiques sur la sensibilité des tiques aux traitements fongiques reste à élucider. Dans la présente étude, des tiques ont été nourries artificiellement avec de la tétracycline et traitées par voie topique avec un champignon entomopathogène. Fait intéressant, une survie similaire a été observée chez les femelles traitées au champignon, qu'elles aient été précédemment nourries avec l'antibiotique ou non. Selon le manuel vétérinaire de Merck Sharp & Dohme Corp. (MSD), le traitement à l'oxytétracycline pour les bovins est de 10 mg−1 kg−1 jour−1. Ici, la concentration de tétracycline ajoutée au sang bovin pour l'alimentation artificielle des tiques a suivi la proportion de 30 mg−1 kg−1 jour−1, basée sur une étude précédente [12]. En conséquence, même lorsqu'elles étaient autorisées à se nourrir d'un repas de sang avec une concentration antibiotique plus élevée, la sensibilité des tiques à M. anisopliae n'était pas affectée. Cela suggère que lorsque les bovins sont sous antibiothérapie avec de la tétracycline, la sensibilité des tiques femelles ne serait pas affectée.

Les communautés bactériennes des tiques traitées avec un antibiotique et un champignon (T+F) présentaient la plus forte proportion de séquences trop rares pour être classées, c'est-à-dire que le nombre de séquences représentant ces espèces bactériennes n'était pas suffisant pour être pris en compte dans l'analyse. Il est donc possible que ces traitements aient permis ensemble l'enrichissement d'un large éventail d'espèces bactériennes. De plus, l'analyse de l'occupation des niches a montré un nombre plus élevé d'espèces spécialisées que de généralistes pour tous les groupes traités par rapport au ctrl, suggérant que tous les traitements pourraient perturber la communauté bactérienne à différents niveaux. L'analyse de la participation relative de la classe bactérienne (CLAM) (Fig. 4) a révélé que les taxons bactériens dans F étaient également observés dans T + F; cependant, les lectures de séquence des cinq taxons les plus abondants étaient plus élevées dans F que dans T + F. Ces faits expliquent donc les différents indices de diversité entre ces groupes. De plus, il y a eu une augmentation du nombre de taxons dans T + F qui ont changé sa composition bactérienne par rapport à F. Les écarts entre F et T + F dans l'analyse de cooccurrence de réseau (Fig. 5) indiquent comment les interactions entre les bactéries et les espèces clés de chaque groupe variaient. Le groupe T + F présentait l'indice de diversité le plus élevé (Fig. 3) contrairement au nombre le plus faible d'espèces clés et d'interactions bactériennes. Les espèces clés ne sont pas nécessairement abondantes, mais elles ont un fort impact sur les autres espèces en fonction du nombre d'interactions [50, 51]. En conséquence, les espèces clés peuvent façonner la composition de la communauté bactérienne en raison de leurs liens étroits. Bien que les données T + F présentent un nombre plus élevé d'espèces (c'est-à-dire un indice de diversité accru), ces espèces n'ont pas établi d'interactions solides, probablement parce qu'il s'agit de bactéries opportunistes qui ne sont apparues qu'en raison d'une perturbation causée par le champignon et les traitements antibiotiques ensemble.

Les micro-organismes endosymbiotiques ont un rôle important chez les arthropodes hématophages obligatoires, fournissant des nutriments rares dans un régime sanguin [4, 52]. Duron et al. [5] ont rapporté qu'Ornithodoros moubata est dépendant de l'endosymbionte Francisella, responsable de la synthèse de la vitamine B. Guizzo et al. [12] ont démontré que pour R. microplus, Coxiella est un endosymbionte critique pour la maturation des métanymphes et la physiologie des tiques. Ces auteurs ont également montré que Coxiella était abondante dans différents tissus des femelles de R. microplus, avec une prédominance dans l'ovaire et les tubes de Malpighi mais des niveaux très faibles dans l'intestin. D'autre part, dans notre étude, Coxiella était le genre bactérien le plus abondant dans les intestins de R. microplus dans tous les groupes sauf T+F. L'abondance plus élevée de ce taxon dans F suggère que l'infection fongique permet l'enrichissement de Coxiella dans l'intestin de la tique, diminuant les autres taxons et réduisant la diversité bactérienne. Ce résultat a également été observé chez Anopheles stephensi après traitement par Beauveria bassiana [27]. Ces auteurs ont rapporté que le symbiote Serratia marcescens a augmenté dans l'intestin du moustique après le traitement fongique. En revanche, ici, les intestins de T + F présentaient la plus faible abondance de Coxiella et la plus grande diversité. Dans ce groupe, la présence réduite de Coxiella résultait probablement de la combinaison de l'administration de tétracycline (un agent à large spectre qui inhibe la synthèse des protéines bactériennes) [53] plus le traitement fongique. Les réductions de Coxiella semblent permettre l'incidence d'autres bactéries dans l'intestin, ce qui pourrait expliquer l'augmentation de la diversité. De plus, certaines bactéries signalées dans la communauté bactérienne de l'intestin des tiques ont été suggérées comme étant résistantes à la tétracycline [54]. Ce fait pourrait expliquer pourquoi l'abondance de Coxiella n'a pas été réduite chez les tiques nourries à la tétracycline (T) par rapport à ctrl, puisque la protéine associée à la résistance a été trouvée chez Coxiella burnetii [55].

À notre connaissance, il s'agit du premier rapport d'interactions entre des bactéries tiques et intestinales et un champignon entomopathogène. Des études antérieures [26, 56] avec différentes espèces d'insectes ont rapporté que des changements dans le microbiote intestinal pourraient améliorer ou altérer l'action fongique entomopathogène en fonction de l'hôte arthropode. Ce résultat pourrait être dû à des variations dans la composition du microbiote des différents hôtes. Ici, la survie des tiques des femelles traitées avec le champignon ayant reçu ou non l'antibiotique (F ou T+F) était similaire. Des résultats analogues ont été observés par Ramirez et al. (2018) [57] avec Aedes aegypti. Selon ces auteurs, la charge bactérienne intestinale réduite n'a pas modifié la virulence fongique entomopathogène, même en utilisant une charge d'inoculum fongique élevée. Il est possible que ces bactéries éliminées (bactéries éliminées après le traitement antibiotique) n'aient pas influencé le succès ou l'échec de l'infection fongique. Cependant, cette étude s'est concentrée sur le test uniquement des femelles adultes de R. microplus et, par conséquent, les effets de la perturbation de la communauté bactérienne dans les phases immatures pourraient avoir un résultat différent.

La présente étude a analysé les intestins des tiques 3 jours après le traitement par M. anisopliae. Cette heure a été choisie sur la base de travaux inédits [Mesquita, E.; Golo, PS] démontrant qu'après 72 h, les conidies LCM S04 auraient déjà germé et pénétré la cuticule de R. microplus, atteignant les organes internes de la tique. De plus, les actions fongiques provoquent une détérioration du corps de l'arthropode au fil du temps, ce qui entrave les méthodes de dissection. En conséquence, ce qui aurait pu se passer après 72 h concernant les interactions bactérie-fongique reste à élucider. Coxiella, Ehrlichia, Caviibacter, Cutibacterium et Escherichia/Shigella étaient les genres les plus couramment observés dans les intestins du groupe ctrl. Le groupe prise de sang et le groupe ctrl ne partageaient que 0,9 % des séquences, suivis de ctrl et T+F, avec 0,1 % de généralistes. Les bactéries identifiées dans les intestins peuvent être héritées principalement par transmission transovarienne, à travers les générations, et à travers la peau de l'hôte [4]. Bien que le veau utilisé ici n'ait montré aucun signe clinique d'anaplasmose, l'analyse moléculaire de l'échantillon de sang a montré qu'Anaplasma était le genre bactérien le plus abondant trouvé dans le sang de cet animal (Fig. 3). Cependant, ce fait indique seulement que l'abondance d'Anaplasma dans le sang était supérieure à celle des autres bactéries, et pas nécessairement un niveau élevé d'infection. Cette perte de taxons entre le sang de l'hôte et la tique peut se produire lors du processus de digestion du sang, puisque l'intestin de la tique a des stratégies de défense contre les micro-organismes invasifs. Cette défense est principalement pilotée par des fragments d'hémoglobine dérivés d'antimicrobiens appelés hémocidines [58]. En plus de cela, les mécanismes de défense intestinale comprennent des molécules telles que des peptides antimicrobiens et éventuellement des espèces réactives de l'oxygène [59].

Le genre Ehrlichia a été trouvé dans les intestins du groupe ctrl mais n'a pas été détecté dans F, T ou T+F. En 2016, Cabezas-Cruz et al. [60] ont décrit une nouvelle espèce, Ehrlichia minasensis, isolée de l'hémolymphe de R. microplus, pathogène pour les bovins. À ce jour, E. minasensis et E. ruminantium sont les seules espèces connues pour infecter naturellement les bovins [61, 62]. Même si l'identification de l'espèce Ehrlichia ou les implications possibles dans son cycle de vie n'ont pas été abordées dans la présente étude, la non-détection de ce genre dans l'intestin des tiques traitées aux champignons soutient l'hypothèse selon laquelle une infection fongique entomopathogène peut avoir un impact négatif sur l'occurrence. d'une bactérie qui cause une maladie transmise par les tiques. Des études ont rapporté les effets des champignons entomopathogènes dans la transmission et le cycle de vie des agents pathogènes à transmission vectorielle après traitement de l'arthropode avec le champignon (à savoir, Glossina fuscipes fuscipes et Trypanosoma congolense) [63] ainsi que d'Anopheles gambiae et Plasmodium falciparum [64 ]. Néanmoins, à notre connaissance, aucune littérature concernant les interactions tiques-pathogènes-champignons, en particulier par rapport aux études sur les insectes, est inexistante. Ici, la perturbation du microbiote intestinal de la tique par le champignon entomopathogène Metarhizium (associé ou non à l'antibiotique) indique une caractéristique exploitable de ce champignon dans son utilisation contre les tiques. Cependant, l'analyse ici était centrée uniquement sur l'intestin de la tique et aucun autre tissu de tique. En conséquence, une enquête plus approfondie est justifiée sur les interactions tripartites entre les tiques, les agents pathogènes et les champignons.

La confrontation de R. microplus avec M. anisopliae modifie la communauté bactérienne de l'intestin des tiques principalement en augmentant l'enrichissement de l'endosymbionte Coxiella. L'administration de tétracycline associée au traitement de M. anisopliae entraîne une réduction spectaculaire de la population de Coxiella et modifie la communauté bactérienne intestinale de R. microplus en augmentant sa diversité bactérienne. Néanmoins, l'antibiothérapie n'influence pas la sensibilité des tiques au champignon entomopathogène.

Les séquences appariées et l'affectation BioSamples de cette étude sont disponibles dans le référentiel NCBI sous le code de projet PRJNA849240.

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Nous apprécions le soutien des étudiants du Laboratoire de contrôle microbien (LCM) et du Laboratoire de santé avicole (LASAVE) de l'UFRRJ, au Brésil.

Richard Alan Humber—Retraité.

Cette étude a été financée en partie par la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior—Brasil (CAPES)—Finance Code 001, fournissant une maîtrise et un doctorat. bourses pour LN Meirelles et TA Correa, et le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) du Brésil, fournissant un doctorat. bourse pour E. Mesquita. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Fondation Carlos Chagas Filho pour la recherche de l'État de Rio de Janeiro (FAPERJ) (numéro de subvention E-26/201.389/2021). VREP Bittencourt, HA Santos et IS Coelho sont chercheurs au CNPq.

Programme de troisième cycle en sciences vétérinaires, Institut vétérinaire, Université rurale fédérale de Rio de Janeiro, Seropédica, Brésil

Emily Mesquita, Laura Nóbrega Meirelles, Thaís Almeida Corrêa, Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt & Patrícia Silva Golo

Laboratoire de microbiologie et d'enzymologie, Université fédérale d'Agreste Pernambuco, Garanhuns, PE, 55292-270, Brésil

Diogo Paes da Costa

Département de parasitologie animale, Institut vétérinaire, Université rurale fédérale de Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Brésil

Mariana Guedes Camargo, Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt & Patrícia Silva Golo

Département de microbiologie vétérinaire et d'immunologie, Institut vétérinaire, Université rurale fédérale de Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Brésil

Irène da Silva Coelho

Département d'épidémiologie et de santé publique, Institut vétérinaire, Université rurale fédérale de Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Brésil

Huarrison Azevedo Santos

USDA-ARS Emerging Pests and Pathogens Research, RW Holley Center for Agriculture and Health, Ithaca, NY, 14850, États-Unis

Richard-Alan Humber

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L'EM, la HAS, l'ISC et le PSG ont conçu l'expérience. EM, LNM, MGC et TAC ont mené les expériences. DPC a effectué l'analyse statistique et bioinformatique des données et de l'art graphique. EM, ISC, HAS, DPS et PSG ont analysé les résultats et rédigé le manuscrit. VREPB, MGC, PSG, ISC, HAS, DPS et RAH ont révisé le manuscrit pour une précision technique et scientifique. Le PSG et le VREPB ont obtenu le financement et supervisé le projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Patrícia Silva Golo.

N'est pas applicable.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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Participation relative de la classe bactérienne dans chaque niche compositrice sur le réseau selon la méthode de classification multinomiale des espèces (CLAM). Les valeurs en pourcentage dans les cases ont été calculées sur une échelle ASV brute pour chaque niche. Les comparaisons des traitements T (A), T + F (B) et B (C) avec le contrôle ont été mises en évidence en raison des contrastes plus importants. Les pourcentages basés sur la transformation log (ASV+1) sont sur l'axe vertical entre parenthèses. Traitements : ctrl - tiques non traitées avec des champignons et préalablement nourries avec du sang pur (groupe témoin) ; F - tiques traitées aux champignons préalablement nourries avec du sang pur ; T + F - tiques traitées aux champignons préalablement nourries avec du sang plus de la tétracycline ; B—échantillon de sang pur du veau.

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Réimpressions et autorisations

Mesquita, E., da Costa, DP, Meirelles, LN et al. Le traitement des champignons entomopathogènes modifie la diversité bactérienne intestinale des tiques Rhipicephalus microplus. Vecteurs parasites 16, 185 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05790-5

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Reçu : 15 février 2023

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05790-5

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